 |
| โครโมโซม |
สารพันธุกรรม หรือดีเอ็นเอ (DNA)
สารพันธุกรรม
หรือดีเอ็นเอ (deoxyribonucleic acid; DNA) เป็นกรดนิวคลิอิก (Nucleic
acid) ที่ทำหน้าที่เก็บข้อมูลทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต
ดีเอ็นเอส่วนใหญ่อยู่ในรูปโครโมโซม (chromosome) วางตัวอยู่
ในส่วนนิวเคลียส ภายในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต ดีเอ็นเอมีหน้าที่สำคัญ ๒
ประการ คือ
๑. การจำลองตัวเอง (DNA replication)
ดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิต
มีความสามารถสร้างและจำลองตัวมันเอง ขณะเกิดกระบวนการแบ่งเซลล์
เพื่อสร้างดีเอ็นเอที่เหมือนเดิม ทุกประการให้แก่เซลล์ใหม่๒. การถ่ายทอดข้อมูลผ่านอาร์เอ็นเอ (transcription)
ดีเอ็นเอสามารถถูกถอดรหัส เพื่อสร้างเป็นอาร์เอ็นเอ (ribonucleic acid; RNA) อาร์เอ็นเอที่ได้นี้จะทำหน้าที่กำหนดการเรียงตัวของกรดอะมิโน ในกระบวนการสังเคราะห์โปรตีน ซึ่งโปรตีนจะถูกนำมาเป็นส่วนประกอบสำคัญ ในโครงสร้างขององค์ประกอบต่างๆ ภายในเซลล์ และเป็นสารเร่งปฏิกิริยาทางชีวเคมี หรือเอนไซม์ (enzyme) ในสิ่งมีชีวิต ด้วยหน้าที่ทั้ง ๒ ประการของดีเอ็นเอ ทำให้สิ่งมีชีวิตสามารถสืบทอดลักษณะประจำพันธุ์ และดำรงเผ่าพันธุ์อยู่ได้
ดีเอ็นเอประกอบด้วยหน่วยย่อยที่เรียกว่า นิวคลิโอไทด์ (nucleotide) ซึ่งเป็นสารประกอบไนโตรจีนัสเบส (nitrogenous base) แบ่งออกเป็น ๒ กลุ่มคือ กลุ่มพิวรีนเบส (purine) ได้แก่ ไทมีน (thymine; T) ไซโทซีน (cytosine; C) และกลุ่มไพริมิดีนเบส (pyrimidine) ได้แก่ อะดีนีน (adenine; A) กัวนีน (guanine; G) โดยสารประกอบไนโตรจีนัสเบสนี้จะรวมตัวกับน้ำตาลดีออกซีไรโบส (deoxyribose sugar) และกรดฟอสฟอริก (phosphoric acid) เป็นนิวคลิโอไทด์อยู่ในดีเอ็นเอ นิวคลิโอไทด์จึงมีอยู่ ๔ ชนิดตามชนิดของไนโตรจีนัสเบส คือ อะดีโนซีนไทรฟอสเฟต (adenosine triphosphate; ATP) กัวโนซีนไทรฟอสเฟต (guano sine triphosphate; GTP) ไซโทซีนไทรฟอสเฟต (cytosine triphosphate; CTP) และไทมิดีนไทรฟอสเฟต (thymidine triphosphate; TTP) การเรียงลำดับของนิวคลิโอไทด์ ทั้ง ๔ ชนิด ส่งผลต่อการเกิดความหลากหลาย และสร้างความแตกต่างในลำดับเบสบนสายดีเอ็นเอ ซึ่งมีความจำเพาะในสิ่งมีชีวิต แต่ละชนิด
โครงสร้างของดีเอ็นเอประกอบไปด้วย สายพอลินิวคลิโอไทด์ ที่เกิดจากการเชื่อมต่อกันของนิวคลิโอไทด์หลายๆ หน่วย ด้วยพันธะ ฟอสโฟไดเอสเตอร์ โดยเกิดจากสายพอลินิวคลิโอไทด์จำนวน ๒ สายเรียงตัวขนานกันในทิศทางตรงกันข้าม เข้าคู่และพันกันเป็นเกลียวเวียนขวาคล้ายบันไดเวียน ที่เรียกว่า ดับเบิลเฮลิกซ์ (doublehelix) การเข้าคู่หรือเข้าจับกันของสายพอลินิวคลิโอไทด์ทั้ง ๒ สาย เกิดจากการเข้าคู่กัน ระหว่างเบสพิวรีน และเบสไพริมิดีน ด้วยพันธะไฮโดรเจน โดย A ทำการสร้างพันธะจำนวน ๒ พันธะเข้าจับกับ T (A = T) และ G ทำการสร้างพันธะ จำนวน ๓ พันธะ เข้าจับกับ C โดยมีน้ำตาล และหมู่ฟอสเฟตทำหน้าที่เป็นแกนอยู่ด้านนอกของโมเลกุล
 |
| วิธีการทางเทคโนโลยีชีวภาพ การสกัดดีเอ็นเอ |
หน่วยพันธุกรรม หรือยีน (Gene)
หน่วยพันธุกรรม หรือยีน (Gene) คือ ดีเอ็นเอส่วนที่เป็นลำดับของรหัสทางพันธุกรรม (Genetic code) สำหรับการสร้างโปรตีนทุกชนิดในเซลล์ของสิ่งมีชีวิต รหัสทางพันธุกรรมเกิดจากการเรียงลำดับของนิวคลิโอไทด์ทั้ง ๔ ชนิด โดย ๑ รหัสพันธุกรรม เกิดจากการเรียงตัวของนิวคลิโอไทด์จำนวน ๓ นิวคลิโอไทด์ (triplet code) รหัสทางพันธุกรรมหนึ่งๆ มีความจำเพาะกับกรดอะมิโน (amino acid) ที่เป็นองค์ประกอบของโปรตีนเพียง ๑ ชนิดจากจำนวน กรดอะมิโนที่มีอยู่ทั้ง ๒๐ ชนิด การเรียงตัวของลำดับ จำนวน และชนิดของกรดอะมิโน ที่แตกต่างกันทำให้เกิดเป็นโปรตีนชนิดต่างๆ
ความแตกต่างของลำดับนิวคลิโอไทด์ บนสายดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด ส่งผลให้เกิดความแตกต่างกัน ในระดับรหัสทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต ทำให้สิ่งมีชีวิตชนิดเดียวกันแต่ต่างสายพันธุ์ ที่มียีนแตกต่างกัน เกิดการสร้างโปรตีน และมีกระบวนการทางชีวเคมีต่างกันออกไป สิ่งมีชีวิตจึงมีความต่าง และความหลากหลาย ในลักษณะทางพันธุกรรมที่ปรากฏออกมา
การค้นหาหน้าที่ของยีนและกลไกการทำงานของยีน สามารถตรวจสอบได้จากผลิตผล หรือลักษณะต่างๆ ที่เป็นการแสดงออกของยีนนั้น ในสิ่งมีชีวิตที่ทำการศึกษา โดยเปรียบเทียบระหว่างยีนปกติ กับยีนที่ทำงานผิดไปจากเดิม หรือยีนกลาย (mutated gene) จากการสกัดแยกยีนที่สนใจออกมาจากสิ่งมีชีวิต ทำการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ และนำมาส่งถ่ายกลับเข้าไปในเซลล์ปกติ แล้วตรวจดูผลที่เกิดขึ้น ทำให้ทราบว่า ยีนนั้นทำงาน หรือควบคุมการแสดงออกของลักษณะทางพันธุกรรมอะไร นอกจากนี้ ยังสามารถทำการดัดแปลงยีนให้สร้างผลิตผลตามต้องการได้ โดยอาศัยเทคโนโลยีการตัดต่อยีน ด้วยวิธีการดัดแปลง หรือปรับปรุงชิ้นส่วนดีเอ็นเอ หรือยีนให้เป็นไปตามที่ต้องการ แล้วทำการส่งถ่ายยีนเข้าสู่สิ่งมีชีวิตเป้าหมาย เพื่อสร้างสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม หรือ GMOs (Genetically Modified Organisms) ต่อไป
ได้มีการนำวิธีการด้านเทคโนโลยีชีวภาพต่างๆ มาใช้ เพื่อศึกษาทางด้านยีนและด้านพันธุกรรม ได้แก่
๑. การสกัดแยกดีเอ็นเอออกจากเซลล์
๒. การตัด ต่อ รวมทั้งการดัดแปลง ชิ้นส่วนดีเอ็นเอ
๓. การเพิ่มปริมาณยีนหรือการโคลน ยีน (gene cloning)
๔. การเพิ่มชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่มีความ จำเพาะจากการทำปฏิกิริยาภายในหลอดทดลอง ในเครื่องควบคุมอุณหภูมิ
๕. การศึกษาชิ้นส่วนดีเอ็นเอด้วยวิธีแยกขนาดและปริมาณ ผ่านตัวกลางที่เป็นแผ่นวุ้นโดยใช้กระแสไฟฟ้า
๖. การตรวจและพิสูจน์ดีเอ็นเอที่มีการเรียงลำดับเบสที่จำเพาะบนแผ่นเม็มเบรน (เยื่อ) พิเศษ (southern bloting)
๗. การหาลำดับเบสบนสายดีเอ็นเอ (DNA sequencing)
๘. การศึกษาความแตกต่างระดับยีน โดยการใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอ
๙. การเพาะเลี้ยงเซลล์และการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ
๑๐. การส่งถ่ายยีนเพื่อการเปลี่ยนแปลง ลักษณะทางพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตที่ต้องการ
เครื่องหมายดีเอ็นเอ
เครื่องหมายดีเอ็นเอ คือ ชิ้นดีเอ็นเอสายสั้นๆ ที่ลำดับเบสสามารถจับกัน หรือเข้าคู่กับช่วงใดช่วงหนึ่งบนสายดีเอ็นเอ หรือโครโมโซมของสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย ทำให้สามารถกำหนด หรือระบุตำแหน่งใดตำแหน่งหนึ่งบนโครโมโซมที่ศึกษา นอกจากนี้ ยังนำมาใช้เป็นเครื่องหมายติดตามหน่วยพันธุกรรมหรือยีนของสิ่งมีชีวิตได้ ความแตกต่าง ที่พบจากการใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอตรวจสอบสารพันธุกรรมจากสิ่งมีชีวิตที่ต่างชนิด หรือต่างพันธุ์กัน เกิดขึ้นจากการเรียงตัวของลำดับของนิวคลิโอไทด์ ในสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิตแต่ละชนิด ที่มีความแตกต่างกัน
เมื่อนำมาทำปฏิกิริยาระหว่างเครื่องหมายดีเอ็นเอชนิดต่างๆ ตำแหน่งการวางตัว และปริมาณของแถบดีเอ็นเอ (DNA band) ที่ปรากฏบนตัวกลาง ในการตรวจสอบภายหลังจากการทำปฏิกิริยาจึงแตกต่างกัน ทำให้สามารถแยกความแตกต่างของสิ่งมีชีวิต ที่นำมาทำการศึกษาได้
เครื่องหมายดีเอ็นเอที่นำมาใช้ในการตรวจสอบหาความแตกต่างของสิ่งมีชีวิต สามารถแบ่งออกเป็น ๒ ประเภทตามหลักการ คือ
๑. วิธีการ RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
เป็นวิธีที่ใช้ดีเอ็นเอตรวจสอบ (DNA probe) ซึ่งเป็นชิ้นส่วนดีเอ็นเอสายเดี่ยวขนาดเล็ก ที่ทราบลำดับเบส และทำการติดฉลากสารกัมมันตรังสี เพื่อใช้ในการติดตามผล นำมาทำปฏิกิริยากับดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตที่สนใจ ที่ถูกแยกเป็นเส้นเดี่ยว และถูกตัดย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzymes) โดยอาศัยความสามารถของดีเอ็นเอตรวจสอบ ที่สามารถเข้าคู่หรือจับกันกับสายดีเอ็นเอเป้าหมาย ตรงตำแหน่งที่มีลำดับเบสเป็นคู่สม (DNA hybridization) กันได้
การใช้เครื่องหมายดีเอ็นเอประเภท RFLP ในการตรวจสอบพันธุ์พืช
๒. เทคนิค PCR (Polymerase Chain Reaction)
เป็นวิธีการเพิ่มปริมาณชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ที่มีความจำเพาะขึ้นในหลอดทดลองโดยทำปฏิกิริยาอย่างต่อเนื่องเป็นลูกโซ่ จากการทำปฏิกิริยาร่วมกันระหว่าง
๑. เอนไซม์ DNA polymerase ที่ใช้ในการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอ
๒. ดีเอ็นเอสายสั้นๆ ๒ สาย หรือไพรเมอร์ (DNA primer) ที่ใช้เป็นจุดเริ่มต้นการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ เป็นตัวกำหนดขนาดของดีเอ็นเอที่ทำการสังเคราะห์
๓. นิวคลิโอไทด์อิสระ และ
๔. สายดีเอ็นเอ เป้าหมาย ภายในหลอดทดลอง ภายหลังการทำปฏิกิริยา จะได้สายดีเอ็นเอใหม่จำนวนมาก ที่ถูกกำหนดขนาดตามระยะห่างของไพรเมอร์ ทั้ง ๒ สาย ที่เข้าจับบนสายต้นแบบ เมื่อเริ่มปฏิกิริยาสังเคราะห์
 |
| การส่งถ่ายยีน |
 |
| การส่งถ่ายยีนโดยใช้เชื้อ Agrobacterium |
การถ่ายทอดยีน
เทคนิคการถ่ายทอดยีนเข้าสู่พืช เป็นวิธีการสำคัญในการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางพันธุกรรมของพืช ให้แสดงออก ในลักษณะทางพันธุกรรม ตามที่ต้องการ โดยวิธีส่งถ่ายสารพันธุกรรมจากภายนอกเข้าสู่เซลล์เป้าหมาย สารพันธุกรรมที่ทำการส่งถ่าย เกิดการแทรกเข้าเชื่อมต่อกับโครโมโซมของเซลล์หรือเนื้อเยื่อเป้าหมาย และเกิดการแสดงออก ในลักษณะทางพันธุกรรม ที่สารพันธุกรรมเหล่านั้นควบคุม รวมทั้งมีความสามารถในการถ่ายทอดลักษณะทางพันธุกรรมนั้นต่อไปยังรุ่นลูกเหมือนในพืชปกติได้ พืชที่ได้รับยีนจากแหล่งอื่นเข้าไปในส่วนของจีโนม และสามารถแสดงลักษณะทางพันธุกรรมที่ยีนนั้นควบคุม เรียกว่า พืชแปลงพันธุ์ (transgenic plants)
พืชแปลงพันธุ์ได้เริ่มเข้ามามีบทบาทสำคัญ ในการผลิตพืชปลูกหลายชนิดให้มีคุณลักษณะที่ดีขึ้น รวมทั้งการลดข้อจำกัดของวิธีการปรับปรุงพันธุ์แบบดั้งเดิม เช่น การผสมพันธุ์พืช (hybridization) และการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ (mutation) ซึ่งต้องใช้ระยะเวลายาวนานในการปฏิบัติ และลักษณะที่แสดงออกภายนอกเป็นการแสดง ออกของยีนจากภายใน จึงมักพบอิทธิพลจากการข่มการแสดงออกของยีนในลักษณะต่างๆ ทำให้เกิดปัญหาในการปรับปรุงพันธุ์ รวมถึงมีโอกาสที่จะได้ลักษณะทางพันธุกรรม ที่ไม่ต้องการร่วมเข้ามาด้วย จากความหลากหลายทางพันธุกรรมที่ลดลง ก่อให้เกิดปัญหา ที่ไม่สามารถหาพืชตระกูลใกล้เคียงกับพืชปลูกมาใช้ เพื่อการผสม ในระบบการปรับปรุงพันธุ์ นอกจากนี้ ลักษณะทางการเกษตรบางประการ เช่น ความต้านทานต่อโรคและแมลง ความต้านทานต่อสภาวะแวดล้อมที่ไม่เหมาะสม ปรากฏอยู่ในพันธุ์พืชป่า หรือในสิ่งมีชีวิตชนิดอื่น ที่มีลักษณะทางพันธุกรรม ห่างจากพันธุ์พืชที่นำมาปรับปรุง จึงไม่สามารถใช้วิธีการผสมพันธุ์พืช เพื่อผลิตพืช ให้มีลักษณะที่ตรงตามความต้องการได้ พืชดัดแปลงพันธุกรรม จึงได้รับการพัฒนาขึ้น เพื่อจุดมุ่งหมายในการเปลี่ยนแปลง เพิ่มเติม หรือตัดทอนลักษณะบางประการของต้นพืช โดยการแทนที่ด้วยยีนควบคุมลักษณะทางพันธุกรรมที่ต้องการ ทั้งที่ได้จากพืชในตระกูลเดียวกัน หรือพืชต่างตระกูล กับพืชปลูกที่ต้องการดัดแปลงพันธุกรรม รวมทั้งยีนจากสิ่งมีชีวิตอื่น ทำให้ได้พืชปลูกที่มีลักษณะตามต้องการในเวลาอันรวดเร็ว และไม่มีผลกระทบจากยีนที่ไม่ต้องการ เหมือนกับการใช้วิธีการปรับปรุงพันธุ์แบบเดิม
ยีนควบคุมลักษณะทางพันธุกรรมที่นำมาใช้ในกระบวนการส่งถ่ายยีน สามารถแบ่งออกเป็น ๒ กลุ่ม กลุ่มแรกคือ ยีนเพื่อการเพิ่มผลผลิต ซึ่งเป็นยีนในกลุ่มที่ช่วยส่งผลต่อการเพิ่มปริมาณของผลผลิต เช่น ยีนต้านทานการเข้าทำลายของโรคและแมลง และยีนสร้างความทนทานต่อสภาพแวดล้อม บางชนิด กลุ่มที่ ๒ คือ ยีนเพื่อการปรับปรุงคุณภาพของผลผลิต ซึ่งเป็นยีนในกลุ่มที่ช่วยปรับปรุงคุณภาพของผลผลิต เช่น ยีนชะลอการสุกแก่ของผลไม้ และยีนเพิ่มปริมาณแป้งและน้ำตาล
การส่งถ่ายยีนเข้าสู่พืชสามารถปฏิบัติได้หลายวิธี ขึ้นอยู่กับชนิด และเนื้อเยื่อของพืช ที่นำมาใช้ ในการส่งถ่ายยีน อาจแบ่งออกเป็น ๒ วิธีการใหญ่ๆ คือ
ก. การส่งถ่ายยีนโดยตรง
เป็นวิธีการส่งถ่ายยีนที่ต้องการเข้าสู่เนื้อเยื่อพืชเป้าหมายโดยตรง เช่น การส่งถ่ายยีนโดยใช้กระแสไฟฟ้า (electroporation) การส่งถ่ายยีนโดยใช้เข็มฉีด (microinjection) การส่งถ่ายยีนโดยใช้เครื่องยิงอนุภาค (biolistic technique)
ข. การส่งถ่ายยีนโดยใช้พาหะ
เป็นวิธีการส่งถ่ายยีนที่ต้องการ โดยส่งถ่ายเข้าไป ในพาหะ เช่น แบคทีเรีย หรือไวรัส ก่อนอาศัยกลไกของพาหะ นำพายีนที่ต้องการเข้าสู่เนื้อเยื่อพืชเป้าหมาย เช่น การส่งถ่ายยีนโดยใช้แบคทีเรีย Agrobacterium (Agrobacterium mediated gene transfer)
วิธีการส่งถ่ายยีนเข้าสู่พืชที่นิยมปฏิบัติในปัจจุบัน และประสบความสำเร็จ ในการถ่ายทอดยีนควบคุมลักษณะทางพันธุกรรมต่างๆ เข้าสู่พืชปลูกหลายชนิด ได้แก่ การส่งถ่ายยีน โดยใช้แบคทีเรีย และการส่งถ่ายยีนโดยใช้เครื่องยิงอนุภาค
๑. การส่งถ่ายยีนโดยใช้แบคทีเรีย Agrobacterium
การส่งถ่ายยีนโดยใช้แบคทีเรีย เป็นวิธีการนำยีนที่ต้องการเข้าสู่เซลล์พืช และเกิดกระบวนการเชื่อมต่อ ระหว่างสารพันธุกรรมที่ทำการส่งถ่ายกับจีโนมของพืช โดยอาศัยกลไกการเข้าทำลายพืชของแบคทีเรียในดิน ที่ชื่อว่า Agrobacterium tumefaciens ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่เข้าบุกรุก และเข้าทำลายพืชทางบาดแผล เป็นเชื้อสาเหตุของอาการปุ่มปม (crown gall) บริเวณลำต้นของพืชใบเลี้ยงคู่หลายชนิด จากความสามารถ ในการส่งถ่ายชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ที่ทำให้เกิดโรคที่อยู่บนดีเอ็นเอพิเศษ มีลักษณะเป็นวงแหวนขนาดเล็กภายในเซลล์ที่เรียกว่า Ti พลาสมิด (Tumour inducing plasmid) เข้าสู่เซลล์พืชบริเวณบาดแผล ชิ้นดีเอ็นเอจะเข้าเชื่อมต่อกับดีเอ็นเอบนโครโมโซมพืช ทำให้เซลล์พืช เกิดการเจริญเติบโตที่ผิดปกติ การส่งถ่ายยีนเข้าสู่พืชโดยใช้แบคทีเรีย Agrobacterium ทำโดยการแทนที่ยีนที่ก่อโรค ด้วยยีนควบคุมลักษณะที่ต้องการ แล้วให้แบคทีเรีย Agrobacterium ทำการส่งถ่ายเข้าสู่พืช เพื่อให้เกิดการแสดงออกในลักษณะตามที่ต้องการ
๒. การส่งถ่ายยีนโดยการใช้เครื่องยิงอนุภาค
การส่งถ่ายยีนโดยการใช้เครื่องยิงอนุภาคเป็นวิธีการส่งถ่ายยีนเข้าสู่พืช ด้วยวิธียิงยีนเข้าสู่เซลล์ ยีนที่ใช้จะนำมาเคลือบไว้บนอนุภาคโลหะขนาดเล็ก เช่น อนุภาคทองคำ หรืออนุภาคทังสเตน ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวนำยีนเข้าสู่เซลล์ โดยใช้แรงผลักดันจากแหล่งต่างๆ เช่น แรงขับจากดินปืน แรงขับจากกระแสไฟฟ้า หรือแรงดันของก๊าซ ซึ่งทำหน้าที่เป็นตัวผลักดันอนุภาคโลหะ เข้าสู่เนื้อเยื่อเป้าหมาย ผ่านผนังเยื่อหุ้มเซลล์ ภายใต้สภาวะสุญญากาศ และเกิดการเชื่อมต่อ ระหว่างยีนที่ต้องการ กับโครโมโซมของเซลล์เป้าหมาย วิธีการส่งถ่ายยีน โดยการใช้เครื่องยิงอนุภาค เป็นวิธีที่พัฒนาขึ้น เพื่อใช้ในการส่งถ่ายยีนเข้าสู่พืชสำคัญบางชนิด เช่น กลุ่มพืชใบเลี้ยงเดี่ยวที่ไม่ตอบสนองต่อการส่งถ่าย ยีนด้วยแบคทีเรีย Agrobacterium
ที่มาและแหล่งข้อมูล
http://kanchanapisek.or.th/kp6/sub/book/book.php?book=28&chap=5&page=t28-5-infodetail02.html http://kanchanapisek.or.th/kp6/sub/book/book.php?book=28&chap=5&page=t28-5-infodetail03.html http://kanchanapisek.or.th/kp6/sub/book/book.php?book=28&chap=5&page=t28-5-infodetail04.html http://kanchanapisek.or.th/kp6/sub/book/book.php?book=28&chap=5&page=t28-5-infodetail06.html
